一、法規(guī)要求

GMP對(duì)于制藥行業(yè)內(nèi)測(cè)試方法需要參照ISO的測(cè)試方法，而ISO 14698-1微生物污染控制法規(guī)提到微生物監(jiān)測(cè)需要評(píng)估收集效率（Collection efficiency ），高的收集效率的采樣方法和采樣設(shè)備可以得到更有代表性的數(shù)據(jù)。對(duì)于生物負(fù)載環(huán)境低的環(huán)境，如A、B級(jí)環(huán)境，應(yīng)當(dāng)更多的采用主動(dòng)采樣的浮游菌采樣，而不是被動(dòng)采樣的沉降菌方法。

對(duì)于微生物采樣器的收集效率提出了進(jìn)行收集效率評(píng)估的指導(dǎo)意見?，F(xiàn)行的2003版的ISO14698對(duì)于收集效率分為物理收集效率和生物收集效率，其中物理收集效率更在意的是采樣方法是否有能力收集到空氣的攜菌粒子，而生物收集效率更在意的是采樣器或者采樣方法是否能在收集到的同時(shí)保證該攜菌粒子的存活率。

二、沉降菌的采樣效率

基于地心引力的被動(dòng)采樣方式，能夠得到12微米粒徑的活性粒子沉降到9cm的采樣平皿上的收集效率為0.106 CFU/h，沉降到14cm的采樣平皿上的收集效率0.256CFU/h。而對(duì)于1微米粒徑的活性粒子沉降到9cm 的采樣平皿上的收集效率為0.008 CFU/h 。如果區(qū)zui大濃度限度為1CFU/m3, 那么一個(gè)9cm平皿需要暴露于區(qū)采樣1250小時(shí)（相當(dāng)于52天），才能在低生物污染負(fù)載環(huán)境檢測(cè)到一個(gè)有意義的數(shù)據(jù)（一個(gè)CFU）。

所以：沉降菌“是一種太不靈敏的采樣方法"，以及“沉降菌更好的反映了攜菌粒子的沉積效果，僅在較大平皿采樣（如14cm）或者多個(gè)采樣平皿采集時(shí)靈敏些"。對(duì)于主動(dòng)采樣方法采集1微米的粒子的收集效率比9cm的被動(dòng)采集的沉降菌方法的效率高2250倍。對(duì)于區(qū)層流環(huán)境的微生物采樣，建議采用更加靈敏的采樣方法。

沉降菌等采樣方法對(duì)于相對(duì)微生物負(fù)載量較高的非無菌工藝的C，D級(jí)環(huán)境，可以作為一個(gè)微生物采樣的補(bǔ)充，配合浮游菌采樣方法可以一起使用。對(duì)于A，B級(jí)環(huán)境，浮游菌采樣方法作為更高效的采樣方法更適合。

三、日常監(jiān)測(cè)中的風(fēng)險(xiǎn)

如大家所知，歐盟GMP無菌生產(chǎn)的附錄一的草案于2017年12月24日發(fā)布，其中非常大的變化在于:

a) 微生物及相關(guān)的提法增加了2倍（原附錄提到23次，新草案提到68次）

b) 對(duì)于風(fēng)險(xiǎn)的提法增加了將近4倍（原附錄提到20此，新草案提到92次）。

因此可以了解監(jiān)管部門對(duì)于微生物和風(fēng)險(xiǎn)的要求重視程度達(dá)到未有的高度。其中對(duì)于日常監(jiān)測(cè)中，新附錄9.7條提到區(qū)的活性粒子（微生物）監(jiān)測(cè)位置應(yīng)該是無菌生產(chǎn)污染風(fēng)險(xiǎn)高的位置，如無菌表面，開口的容器膠塞等。而在9.29條提到，活性粒子（微生物）的采樣方法不應(yīng)當(dāng)對(duì)于制藥生產(chǎn)帶來任何污染的風(fēng)險(xiǎn)(Reference 2)。因此，我們可以看到監(jiān)管部門的想法，他既認(rèn)為微生物監(jiān)測(cè)非常重要，又認(rèn)為采用不恰當(dāng)?shù)牟蓸臃椒〞?huì)對(duì)生產(chǎn)環(huán)境帶來負(fù)面影響。

這是我們行業(yè)的一個(gè)兩難。之前很多企業(yè)由于無法找到一個(gè)合適的微生物方法，擔(dān)心浮游菌采樣方法的平皿頻繁更換會(huì)對(duì)制藥環(huán)境帶來污染，因此決定不進(jìn)行主動(dòng)微生物（浮游菌）監(jiān)測(cè)。隨著現(xiàn)代制藥工業(yè)發(fā)展，我們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了需要提升我們對(duì)于微生物采樣方法的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別。

沉降菌方法可能會(huì)對(duì)于環(huán)境造成污染，我們知道沉降菌表面有大量的營養(yǎng)水分，在10微米至20微米之間，當(dāng)沉降菌暴露在關(guān)鍵生產(chǎn)的環(huán)境中，這些營養(yǎng)水分很可能會(huì)被吹到無菌表面，藥瓶容器內(nèi)，藥液當(dāng)中，造成污染和交叉污染。

浮游菌采樣由于培養(yǎng)基比較容易干燥，現(xiàn)代的采樣流速設(shè)計(jì)為低流速采樣，可以盡量的延長浮游菌采樣的覆蓋生產(chǎn)的時(shí)間，不要頻繁進(jìn)行平皿更換介紹。通常會(huì)考慮到層流環(huán)境的氣流保護(hù)的目的，我們對(duì)浮游菌采樣也要進(jìn)行等動(dòng)力采樣設(shè)計(jì)，確保采樣器上方的空氣呈現(xiàn)等速采樣，不會(huì)對(duì)現(xiàn)場造成污染。

傳統(tǒng)的微生物采樣方法為把整個(gè)采樣器放入環(huán)境，而現(xiàn)代的無菌工藝控制方法要求任何進(jìn)入的材料設(shè)備都要進(jìn)行充分的滅菌。傳統(tǒng)方法把采樣器放入，由于采樣器內(nèi)部的線路板電氣部件無法進(jìn)行的滅菌，通常企業(yè)采樣VHP或者酒精消毒采樣器表面，無法到達(dá)的滅菌的效果。WHO無菌工藝控制要求中建議制藥企業(yè)應(yīng)當(dāng)采樣分體式的微生物采樣方法，即把采樣頭和采樣器進(jìn)行分離，采樣頭放入并可提前進(jìn)行高溫或者化學(xué)滅菌，而采樣器放在B級(jí)背景環(huán)境進(jìn)行操作。這樣的話，可以規(guī)避采樣器無法滅菌對(duì)于區(qū)的影響。

結(jié)論

綜上而述，經(jīng)過效率驗(yàn)證的浮游菌采樣方法對(duì)比沉降菌采樣方法的收集效率更為高效，適合用于關(guān)鍵的，生物負(fù)載低的無菌生產(chǎn)環(huán)境。而沉降菌采樣方法可作為一種生產(chǎn)過程中浮游菌采樣的補(bǔ)充方法，可用于相對(duì)不關(guān)鍵，生物負(fù)載高的非無菌環(huán)境，使用時(shí)需要避免放置位置不當(dāng)或者操作錯(cuò)誤而造成的污染風(fēng)險(xiǎn)。無論采用何種方法，都應(yīng)當(dāng)基于生產(chǎn)工藝的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估來確定位置，采樣頻率，采樣覆蓋時(shí)間以及采樣流速等。